細菌的生理和生化試驗

發布時間：

2022-11-16

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細菌的生理和生化試驗

微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物,生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物.因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一,微生物檢驗中常用的生化反應介紹如下:

糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣.可用指示劑及發酵管檢驗.

試驗方法:以無菌操作,用接種針或環移取純培養物少許,接種于發酵液體培養基管中,若為半固體培養基,則用接種針作穿刺接種.接種后,置36±1.0攝氏度培養,每天觀察結果,檢視培養基顏色有無改變產酸,小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產氣陽性,若為半固體培養基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力,培養物可呈彌散生長.本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力,從而進行各種細菌的鑒別,因而每次試驗,常需同時接種多管.一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍和An-drade指示劑.

淀粉水解試驗

某些細菌可以產生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖.淀粉水解后,遇碘不再變藍色.

試驗方法:以18至24h的純培養物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板一個平板可分區接種,試驗數種培養物或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1攝氏度培養24至48h,或于20培養5天.然后將碘試劑直接滴浸于培養表面,若為液體培養物,則加數滴碘試劑于試管中.立即檢視結果,陽性反應淀粉被分解為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化.陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色.

淀粉水解系逐步進行的過程,因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間,培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系.培養基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適.淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時制備為妥.

V-P試驗

某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環境下,被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V－P+反應.

試驗方法

O’Meara氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1攝氏度培養48h,培養液1ml加O’Meara試劑加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液1ml,搖動試管1至2分鐘,靜置于室溫或36±1攝氏度恒溫箱,若4h內不呈現伊紅,即判定為陰性.亦有主張在48至50攝氏度水浴放置2h后判定結果者.

Barritt氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1攝氏度培養4天、培養液2.5ml先加入a萘酚2-na-phthol純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2至5分鐘,陽性菌常立即呈現紅色,若無紅色出現,靜置于室溫或36±1攝氏度恒溫箱,如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性.

快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環,乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動后放置5分鐘,判定結果.不產酸的培養物不能使用.

本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別.在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時,通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生,故應省去或以氯化鈉代替.

甲基紅Methyl Red試驗

腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸,進一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物,可使培養基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅.

試驗方法:挑取新的待試純培養物少許,接種于通用培養基,培養于36±1攝氏度或30攝氏度以30攝氏度較好3至5天,從第二天起,每日取培養液1ml,加甲基紅指示劑1至2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色,陰性為黃色.迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果.

甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4至6.0,其pK值為5.0.故在pH5.0以下,隨酸度而增強黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應延長培養時間,重復試驗.

靛基質Imdole試驗

某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚.吲哚的存在可用顯色反應表現出來.吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物.

試驗方法:將待試純培養物小量接種于試驗培養基管,于36±1攝氏度培養24h時后,取約2ml培養液,加入Kovacs氏試劑2至3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質,待其浮于培養液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴,在接觸面呈紅色,即為陽性.

實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應,若先用二甲苯或乙醚等進行提取,再加試劑,則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色,因而結果更為可靠.

硝酸鹽Nitrate還原試驗

有些細菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等.亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗.

試驗方法:臨試前將試劑的A磺胺酸冰醋酸溶液和Bα－萘胺乙醇溶液試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面,立即或于10分鐘內呈現紅色即為試驗陽性,若無紅色出現則為陰性.

用α-萘胺進行試驗時,陽性紅色消退很快、故加入后應立即判定結果.進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照.α-萘胺具有致癌性、故使用時應加注意.

明膠Gelatin液化試驗

有些細菌具有明膠酶亦稱類蛋白水解酶,能將明膠先水解為多肽,又進一步水解為氨基酸,失去凝膠性質而液化.

試驗方法:挑取18至24h待試菌培養物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養基.于20至22培養7至14天.明膠高層亦可培養于36±1.每天觀察結果,若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細菌液化,如確被液化,即為試驗陽性.平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10至20分鐘后,菌落周圍應出現清晰帶環.否則為陰性.

尿素酶Urease試驗

有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色.尿素酶不是誘導酶,因為不論底物尿素是否存在,細菌均能合成此酶.其活性最適pH為7.0.

試驗方法:挑取18至24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中,搖均,于36±1培養10,60和120分鐘,分別觀察結果.或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面,不要到達底部,留底部作變色對照.培養2,4和24h分別觀察結果,如陰性應繼續培養至4天,作最終判定,變為粉紅色為陽性.

九、氧化酶Oxidase試驗

氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素C氧化,然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應.

試驗方法:在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1至2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色至深紫色,Ewing氏改進試劑呈藍色.陰性者無顏色改變.應在數分鐘內判定試驗結果.

硫化氫H2S試驗

有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物.

試驗方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中,沿管壁穿刺接種,于36±1培養24至28h,培養基呈黑色為陽性.陰性應繼續培養至6天.也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營養肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養基上空,以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1培養1至6天.紙條變黑為陽性.

三糖鐵TSI瓊脂試驗

試驗方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1培養18至24h,觀察結果.

本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣變黃；產生硫化氫變黑.葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色.