大型真菌菌種保藏的基本原則方法及技術
發布時間：
2022-11-16
作者：
做培養基試劑的廠家日水生物
大型真菌菌種保藏的基本原則方法及技術
范圍
本規程規定了大型真菌菌種保藏的基本原則、方法及技術要求.
本規程適用于各類大型真菌菌種的保藏.
術語與定義
大型真菌macrofungi
大型真菌是菌物中形成大型子實體的一類真菌,泛指廣義上的蘑菇或蕈菌.
程控降溫controlledratefreezing
液氮超低溫保藏preservationinliquidnitrogen
液氮超低溫保藏技術是將菌種在-196的液態氮,或在-150的氣態氮中長期保藏的方法,其原理是利用生物在-130以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物.
原理
菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營養等手段,以達到最大限度地降低菌種的代謝強度,抑制菌絲的生長和繁殖,使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態,從而延長菌種的保藏時間.
技術要求
不同菌種應根據要求選擇適合的培養基進行培養
接種須無菌操作,避免雜菌污染
定期檢查
保藏期間要定期檢查保藏菌種的冰箱溫度和濕度;檢查保藏器皿的棉塞有無生霉現象,如發現異常則立即取出該管重新純化,經培養后補上空缺;在低倍解剖鏡下抽樣檢查有無螨蟲等害蟲,發現時須及時消除.
方法與步驟
斜面低溫保藏法
將要保藏的菌種接種在斜面培養基上,20-30培養,當菌絲長滿斜面時取出,置于4冰箱或冰柜中保藏,每隔3-6個月轉接1次,具體間隔時間應根據菌種特性確定.
保藏設備和材料
冰箱、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養箱、酒精燈、三角瓶、接種針、試管、培養皿、漏斗、燒杯、吸管、瓊脂粉等等.
斜面的制備
器皿的準備:在斜面制備的過程中要用到的一些玻璃器皿,如試管、培養皿、三角瓶、漏斗等,使用前洗凈,并于80烘干備用.
培養基的制備:在燒杯中倒入500毫升水,按配方稱取材料,依次加入水中,逐個溶解,最后定容至1L(在加料過程中,先加緩沖化合物,然后是主要元素、微量元素,最后加維生素等).冷卻至室溫,調pH值.然后將瓊脂粉加入煮沸的液體培養基中,不斷攪拌至融化為止,最后補足蒸發的水分.
分裝:將配好的固體培養基趁熱進行分裝,裝入試管中的培養基不宜超過試管高度的四分之一.在分裝過程中,應注意勿使培養基沾污管口,以免弄濕棉塞造成污染.
滅菌與擺放斜面:將包扎好的培養基滅菌(0.1MPa,30分鐘).滅菌完畢后擺放斜面時,斜面長度不得超過試管管長的一半.
無菌檢查:將制備好的斜面放入30培養箱中培養3天做無菌檢查.
接種:在超凈工作臺上,用無菌接種針挑取菌絲體連同少量培養基,接種于適宜的無菌新鮮培養基斜面上,在管壁或小瓶外壁上分別貼好標簽標明菌株編號(或名稱),然后置于適宜溫度的培養箱中培養.
培養:培養4-30天后,根據菌落的形態和其它培養特征,判斷新培養物是否為原菌種,并注意有無雜菌污染現象.檢查無誤后,進行保藏.
低溫保藏:培養好的斜面于4-6保藏,相對濕度,通常在50%-70%以下.
保藏時間:一般3-6個月.
菌種的轉接:將斜面培養物轉接到適宜的新鮮斜面上,在適宜的培養條件下進行培養.
菌種的復壯:如果發現菌種有退化現象,應將退化的菌種引入原來的生活環境中使其生長和繁殖,然后再進行純種分離,例如在宿主體內生長等方法進行復壯.
斜面低溫保藏法應注意事項:每次轉接時,應仔細核對各菌株的編號、所用培養基等,發現錯誤立即糾正.
每次轉接培養后,應對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄,檢查其培養特征,核實無誤后,再行存放.
斜面低溫保藏的菌種,一般每個菌株應保藏相繼的三代培養物,以便對照.
液氮超低溫保藏法
保藏設備和材料:液氮罐、程控降溫儀、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養箱、酒精燈、培養皿、打孔器、安瓿管(圓底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管),10%甘油或5%或10%的二甲基亞砜、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉等.
安瓿管的清洗和消毒:安瓿管(2毫升)使用前先用自來水沖洗,再用蒸餾水漂洗,于80烘箱烘干.將標簽放入安瓿管上部,滅菌(0.103MPa,30分鐘),備用.
保護劑的配制和滅菌:一般常用甘油或二甲基亞砜作保護劑.將甘油配成10%的溶液,滅菌(0.1MPa,30分鐘),備用;或二甲基亞砜配成5%或10%的溶液,過濾滅菌,備用.
菌種的準備:將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂或綜合馬鈴薯培養基平板上,20-28下培養,待菌絲長滿后,用無菌打孔器從平板上切取大小均勻的小塊(直徑約5-10mm),轉入安瓿管中;或在安瓿管中加1.2-2毫升的瓊脂培養基,接種,培養2-10天.最后加1.5毫升保護劑,封口.
凍結:一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1為好,使樣品凍結到-35.
目前常用的有三種控溫方法
程控降溫法:應用電子計算機程序控制降溫裝置,可以穩定連續降溫,能很好地控制降溫速率.
分段降溫法:將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫.一般采用二步控溫,先將安瓿管或塑料小管置于-20至-40冰箱中1-2小時,然后取出放入液氮罐中快速冷凍.這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5.
對耐低溫的微生物、可以直接放入氣態或液態氮中.
保藏:在氣相中-150,液相中-196.
保藏時間:一般10年以上.
轉接方法:從液氮罐中取出安瓿管,立即放入38-40溫水中,快速復蘇.為了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,待表面干燥后,用已消毒過的剪刀在安瓿管一端敲開或開啟塑料小管,將內容物移至適宜的培養基上,并置于適宜溫度的培養箱中進行培養.
液氮保藏應注意事項
防止凍傷,操作注意安全,戴面罩及皮手套;
安瓿管要用圓底的.若用塑料管一定要擰緊管蓋;
運送液氮時一定要用專用特制的容器,絕不可用密閉容器存放或運輸液氮,切勿使用保溫瓶存放液氮;
注意存放液氮容器的室內通風,防止過量氮氣使人窒息;
當從液氮容器取出安瓿管時,要特別小心,防止破裂爆炸;
注意觀察液氮容器中液氮的殘存量,定期填充液氮.