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    1. 中國藥典微生物技術培訓問答會

      發布時間:

      2022-11-16

      作者:

      培養基問答


      中國藥典培訓問答會
       
      請問:以第五代菌做陽性對照,實驗過程中的接種按藥典應該也算傳代,那是否算是第六代菌呢?  答:依然算第五代(接種的菌株算第5代,培養后算第6代)
      其實驗結果是算哪一代菌的?  答:見上題
       
      藥典規定只能傳代五次,此次實驗結果是否有效?  答:有效
       
      現在有無對照菌種可以購買?聯絡電話?  答:省藥檢所業務科銷售藥典規定的標準菌株,為第二代甘油凍存管.
       
      菌種發放單應包括什么信息?  答:根據自己工作的需要,大致包括:菌種名稱,編號,來源,接收日期,接收人等.
       
      如何檢查黑曲霉孢子懸浮液孢子含量為50~100個/ml.銅綠假單胞菌單菌如果用甘油冷凍管,也是低溫,是否也會影響它的活性?應如何保存?  答:可用玫瑰紅鈉瓊脂培養基或改良馬丁瓊脂來確定黑曲霉孢子懸浮液.銅綠假單胞菌應使用最終甘油濃度為20%的甘油凍存管保存,保存在-30℃或更低溫度,則可保持其活性.若是斜面或營養肉湯,建議室溫保存.
       
      工作菌株,25℃下可連續使用一周,這里的工作菌株是指原液還是制備好的菌懸液.為何工作菌株不低溫存放,而是25℃?  答:首先要說明,所有的操作應按藥典要求來操作,這里的工作菌株指原液,工作菌株建議在2-8℃保存,但要注意的是,銅綠假單胞菌的工作菌液不能低溫保存,低溫會損傷其活性.由于筆誤,寫成了25℃,請更正為2-8℃.
       
      簡單方便的厭氧培養方案?  答:硫乙醇酸鹽培養基;固體培養基的話可考慮使用一次性厭氧袋.
       
      甘油凍存管一定要-30℃嗎?0℃以下不可以嗎?  答:詳見《中國藥品檢驗標準操作規范》2010版341頁.我們的甘油凍存管保存在-30℃.
       
      三糖鐵斜面穿刺會斷層,這是為什么?  答:產氣菌產氣使培養基斷層,或培養基本身質量問題.
       
      第一代菌種可不可以作為工作菌株使用?  答:我們不這樣使用,因為擔心菌株沒有充分復壯,生化特性可能不典型.
       
      制備菌懸液時,要使其在10~100cfu中,應多注意的地方是什么?  答:制定標準化操作規程,減少不同實驗者帶來的誤差,接種量、培養溫度和時間應每次一致.
       
      銅綠假單胞菌不宜放冰箱內保管,但其營養肉湯液能否放在冰箱保管?  答:詳見《中國藥品檢驗標準操作規范》2010版341頁.能否放冰箱可自行驗證.
       
      黑曲霉的存放期如何驗證?  答:通過孢子懸液計數和菌落特征,進行驗證.
       
      標準儲備菌株必須進行純度和特性確認?還是在必要情況下才做?  答:詳見《中國藥品檢驗標準操作規范》2010版341頁,我們在制備標準貯備菌液前進行純度和特性確認,最好在使用前再進行純度和特性確認.
       
      銅綠假單胞菌貯存溫度應為多少度?  答:一般在10℃以上,甘油凍存管至少在-30℃以下.
       
      制備工作菌種進行菌種保藏中的保存期是否要進行驗證?  答:可參考2010年版《中國藥典》標準操作規程(SOP),應進行驗證.
       
      驗證用菌株可否使用ATCC?  答:如果按中國藥典檢驗的,用CMCC
       
      菌種鑒定該如何做?  答:請參考講義內容.
      藥典菌懸液制備是要菌種的新鮮培養物接種至培養基中,培養18-24h再進行稀釋,制備菌懸液,可否直接使用未過期工作菌種進行稀釋來制備菌懸液?  答:按藥典要求不行,如要使用,請自己驗證.
       
      斜面低溫保藏法:每一次的菌種傳代都需要做菌種純度鑒定嗎?  答:建議制備斜面保存管前進行菌種純度鑒定,以后的每次傳代視具體情況而定.
       
      如何比較快速有效判斷菌液的濃度?除了可以用“比濁儀”參考,還有什么方法?    答:比濁儀只做輔助參考,還需通過平板計數來最后確認菌液的濃度.
       
      曾于中檢所中購買過黑曲霉的0代包子懸液,說明書上表示應于-20℃中保存,可保存一年,對于此保存唯獨及效期,藥企可否同法保存自制的黑曲霉孢子懸液?是否要驗證?如何驗證?    答:黑曲霉孢子懸液制備請參照2010版藥典的相關內容.關于驗證在前面的問題中已經回復.
       
      菌種純度確認,怎么確認,需確認哪些項目?    答:請參照2010版藥典的相關內容.
       
      細菌菌種接入營養肉湯中保存一周,這需要驗證嗎?  答:建議做驗證.
       
      菌種斜面最多能保存菌幾代?經冰箱保存的斜面菌種是否需復蘇二次才能進行菌懸液配制?  答:藥典規定,菌種傳代不應超過5代.冰箱保存的斜面菌種復蘇后即可使用.
       
      革蘭氏染色的時間一般多長時間,染色時間長了對結果有無影響?  答:詳見講義內容,應嚴格控制染色時間,否則對結果影響很大.
       
      哥倫比亞血瓊脂平皿生長的菌落,對氧化酶試驗是否有影響?菌懸液的制備過程中,接種菌種新鮮培養物至營養肉湯或營養瓊脂培養基中,這個新鮮培養物怎么理解,冰箱保存斜
      面菌種是新鮮培養物嗎?  答:沒使用過哥倫比亞血瓊脂及相關實驗.新鮮培養物指剛培養好的菌株,冰箱保存斜面菌種不算新鮮培養物.
       
      菌種鑒定時,一定要根據藥典的所有試驗做完,才能確認是某種菌株嗎?可否省略一些試驗?  答:請按藥典規定來進行菌種鑒定,具體情況可能還要增加適宜的鑒定試驗.
       
      工作菌株可在25℃連續使用一周,是指同一代同一管的菌株嗎?還是說同一代不同管的菌株?  答:筆誤更正,同上一題.
       
      若沒有比濁儀,用什么方法來確認50~100cfu/ml?特別是孢子?  答:孢子計數建議通過平板計數的方法來確定濃度.
       
      工作菌種是否可以使用后再次冷藏使用(斜面保藏法)?  答:請自行掌握.
      大腸埃希菌鏡檢時,有時固定好的菌在染色過程中脫落,請問是什么原因引起這種情況?  答:首先,洗干凈撥片,挑菌注意不要太多,待菌固定好后再進行染色.
       
      生孢梭菌,菌落培養計數時一定要在厭氧條件下進行嗎?  答:是
       
      菌懸液怎樣在24h內確定其菌落數?請講解細菌和真菌的方法.  答:平板計數方法.
       
      生孢梭菌培養時,怎樣做才能使其在厭氧中培養?  答:詳見2010版藥典
       
      菌種的純度鑒定包括哪些內容?如果是跟省藥檢所買的3代菌是否就不用做純度或確認試驗?  答:省所現在銷售的是第二代的甘油冷凍管,嚴格來說,請做純度確認.
       
      為什么有時候細菌管會長真菌,而真菌管也會長細菌.  答:原因可能是多方面的,某些細菌適宜在真菌培養基上生長,而某些真菌也能在細菌培養基上生長.比如2010版藥典無菌檢查法,兩種培養基的使用范圍已刪去,已不是絕對的細菌培養基或真菌培養基.
       
      在做方法驗證時,黑曲霉菌濃度大于20cfu/皿時,培養5天后菌落蔓延擴散,無法各個區分,如何在藥典要求的50~100cfu和實際操作結果中找到平衡?因為菌濃對回收率及操作RSD%影響很多.  答:培養48-72h后,菌落剛形成時,及時點計并做記號,然后每天觀察有無新的菌落長出并計數.
       
      標準菌黑曲霉在傳代前需要先接到改良馬丁培養基復蘇后,再傳代,如果需要,接到改良馬丁培養基后培養時間怎么定?  答:2010版藥典規定,黑曲霉傳代,培養時間為5~7天
      有時候在玫瑰紅鈉瓊脂或營養瓊脂平板上生長有酵母菌,在酵母菌生長的位置底部產生了一個氣泡狀的圓形,把底部的瓊脂都貢起來了,又或者表面沒有任何菌落,而瓊脂被貢起來,請問這種圓形氣泡是菌嗎?在計數時是否也把它算入酵母菌?  答:建議挑取氣泡內含物接種至改良馬丁瓊脂培養基中,若能生長,且為酵母菌的菌落形態,應該可以將其算入酵母菌.
       
      大腸生化實驗中的靛基質試驗(I)項結果為“+”或者“-”均不影響最終結果的判斷,請問該項的意義何在?是否可以取消?  答:反應為+,為典型大腸埃希氏菌,-為非典型大腸埃希菌.關系到最終判斷,都是必須的實驗,不可取消.
       
      生化檢查用的鑒定盒是否需要跟培養基一樣做適用性檢查?如果需要做,應該如何進行?  答:用陽性菌做一次,實驗結果相符即可.
       
      銅綠假單胞菌用什么方法保存及更活處理方法?  答:建議采用甘油凍存管(終濃度為20%的甘油凍存管),-30℃(或更低溫度)保存.
       
      工作菌種每代可保存多長時間(斜面低溫保藏法)才傳下一代?  答:教科書上的保存時間為1-6個月.
       
      工作菌株的使用記錄(時間、用途、使用者等)是否需要建立臺賬?  答:是
       
      菌株的純度和特性要多久確認一次,最短時間和最長時間分別是多少?  答:做標準儲備菌株之前務必要進行鑒定,其它根據實際情況:如污染、活性下降、儲存條件發上改變等.
       
      革蘭氏染色前,菌落是否要先純化(接到營養瓊脂斜面上)還是直接從選擇性培養基上挑起菌落直接染色?  答:要純化,從選擇性培養基挑取單個菌落,最好先接到營養瓊脂斜面后,再進行染色.
       
      真菌接至改良馬丁液體培養基中,培養時間為多長?(白色念珠菌、黑曲霉)  答:見2010版藥典.
       
      菌種鑒定一定要做到生化鑒定嗎?  答:要.可以選擇傳統的生化試驗鑒定,也可選擇鑒定儀或鑒定試劑條.請視自身情況而定.
       
      是否可按10版藥典中抑制控制菌檢驗判定方法進行?比如金葡菌做甘露醇平板分離,革蘭染色,血漿凝固酶為陽性就可以了.  答:金葡這樣做可以.其他菌株視具體情況而選擇適宜的鑒定試驗.
       
      請介紹一下,有什么簡便的方法滅菌甘油?  答:高壓濕熱滅菌法
       
      黑曲霉孢子懸液貯存期驗證怎么做.  答:請參考前面該問題的答復.
       
      銅綠假單胞菌瓊脂斜面變紅,是否會造成菌種變異?如何避免該情況出現?(本菌株于25℃保存)  答:出現這樣的情況建議對菌種純度進行鑒定.實驗操作請注意防止污染.
       
      沙門菌穿刺于三塘鐵瓊脂斜面后,由試管底部向上分別出現黃→黑→紅,三種顏色,如何解釋?  答:請看講義內容.
       
      銅綠假單胞菌菌懸液是否也可在2~8℃保存,24小時內使用?  答:不建議,請自己驗證.
       
      是否一定要使用CMCC的菌株嗎?  答:藥典是這樣規定的.
       
      假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以嗎?  答:請按藥典規定來進行實驗,若是藥品檢驗,請用CMCC菌株.
       
      可以用液氮保藏甘油冷凍管嗎?可以的話應該怎么操作?  答:可以.具體操作不清楚.我們沒有液氮保存罐.
       
      貴所有開展支原體檢查法這個實驗嗎?  答:沒有
       
      制備菌懸液的時候,培養物用的營養肉湯用量是多少?  答:沒有具體規定,請自行制定.
       
      制備菌懸液的時候怎樣保證他是50cfu呢?具體說一下操作方法  答:自行摸索一套方法,固定下來,以后就按該方法做就可以了.
       
      請問菌種斜面最好多長時間轉接一次?  答:參考上一題.
       
      20%甘油v∕v是用水還是用相應培養基做稀釋?  答:用相應的培養基.
       
      驗證或做培養基的適用性檢查時,若實際操作制得的菌懸液,經測定計數后不在規定的范圍內,如>100cfu,是否應判本次實驗無效,應重試?若試菌,真菌生長較慢,不能短期內預算菌數,如何解決?  答:第一個問題,請重試.第二個問題,請注意積累平時實驗經驗,標準化操作,慢慢摸索稀釋的倍數.
       
      有時候酵母菌在玫瑰紅鈉平板上不易觀察,是否可用孟加拉瓊脂培養基代替來作培養?  答:藥品檢驗請嚴格按藥典規定,若是平時科研,應該可以用孟加拉紅瓊脂培養基代替.
       
      菌種的每一次傳代(如3代→4代→5代)都必須做菌種鑒定實驗嗎?  答:視具體情況而定.
       
      如何控制菌液的濃度為50~100cfu/ml?  答:見前面問題的回復.
      菌種的傳代,營養肉湯或改良馬丁0.5ml~0.8ml復蘇凍干菌粉→直接涂布于營養瓊脂培養基或改良馬丁瓊脂培養箱→是第一代還是第二代?  答:凍干菌粉為第0代,若凍干菌粉未經過培養,直接涂布到培養基上,為第1代.
       
      請教一個有關微生物限度檢查的問題,在制備10~100cfu菌液時除了你說的比濁法,比較普遍的就是平板計數法,而其中用到的六種試驗菌,細菌用營養瓊脂計數,霉菌用玫瑰紅鈉瓊脂平板計數,其它四種菌應用何種培養基計數?  答:不知道此處所說的其他4種指的是什么菌.
       
      只用平板計數,結果準確嗎?還有沒有其他方法制備10~100cfu菌懸液?  答:這是一個很好的課題,若感興趣,你們可以好好研究一下.
       
      什么叫比濁法(黑曲霉)?  答:關于比濁法的定義和原理,請上網查百度百科,上面有詳細的講解.
       
      大腸埃希菌檢查中,MUG培養基配制后顯熒光是什么原因?  答:有可能試管玻璃材質自發熒光,也可能清洗不干凈,或培養基本身質量,比如有無發生污染等.
       
      請問可用何種培養基或手段鑒定枯草芽孢桿菌?eg:大腸埃希菌用EMB,金黃色葡萄球菌用甘露醇  答:目前尚未有合適的選擇性培養來鑒定枯草芽孢桿菌,可選用API或細菌鑒定儀等手段來鑒定.
       
      如何制備50~100cfu的懸液?有什么方法可以測定具體濃度?  答:參考上題
       
      請問:細菌鑒定儀有哪些用途?能夠鑒定沙門菌屬下的各種沙門菌么?怎樣應用?  答:如有需要,可聯系梅里埃的技術支持人員:13503006367霍工.他會詳細解答你想問的問題.
      黑曲霉菌在2~8℃保存經驗證后能否延長使用時間?  答:藥典規定在驗證過的期限內使用.
       
      菌種的保藏可否用液體石蠟保藏?與甘油冷凍保藏有何區別?  答:藥典未記載液體石蠟保藏法,部分參考書記載斜面保藏法或半固定保藏法可加滅菌石蠟覆蓋.
       
      用于驗證試驗的菌株是否經驗證均能承受1000ml沖洗?  答:未驗證,請咨詢藥典會.
      傳代支原體和其它的菌種一樣嗎?  答:不清楚
      什么叫亞培養?  答:請咨詢藥典會.
       
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