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    1. 化妝品微生物標準檢驗方法綠膿桿菌

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:

      成品培養基干粉


      化妝品微生物標準檢驗方法綠膿桿菌
       
      綠膿桿菌在自然界分布甚廣,空氣、水、土壤中均有存在.對人有致病力,常引起人皮膚化膿感染
      特別是燒傷.燙傷、眼部疾病患者被感染后.常使病情惡化,并可引起敗血定.因此,在化妝品衛生標準中規定不得檢出綠膿桿菌
       
      方法提要
      根據本菌生物學特征:革蘭氏陰性桿菌.氧化酶陽性,能產生綠膿蘭素.此外還能液化明膠,還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,在42攝氏度條件下生長等,可與類似菌相區別
       
      培養基和試劑
      SCDLP液體培養基
      SCDLP液體培養基圖片
      見0B7918.1-87《化妝品微生物標準檢驗方法總則)
      十六烷三甲基澳化銨培養基
      成分:牛肉青3克,蛋白胨.10克,氯化鈉.5克,十六燒三甲基溴化銨.0.3克,瓊脂20克,蒸餾水1000毫升
      制法:除瓊脂外.將上述成分混合加熱溶解,調pH為7.4~7.6,加入瓊脂.115攝氏度(101)20分鐘滅菌后,制成平板備用
       
      乙酰胺培養基
      成分:
      乙酰胺.10.0克,氯化鈉5.0克,無水磷酸氯二鉀1.39克,無水磷酸二氫鉀0.73克,硫酸鐵(M克SO,●7H,O)0.5克,酚紅0.012克,瓊脂20克,蒸餾水1000毫升
      制法:除瓊脂和酚紅外,將其他成分加到蒸儒水中.加熱溶解,調pH為7.2,加入瓊脂、酚紅,121攝氏度
       
      (151lb)20分鐘高壓滅菌后,制成平板備用
       
      綠膿菌色素測定用培養基
      成分,蛋白胨20克,氯化鎮1.4克,硫酸10克,瓊脂8克,甘油(化學純)15克,蒸餾水1000毫升
      制法:將蛋白胨、氟化鐵和磽酸鉀加到蒸餾水中.加溫使溶解,調明H至7.4.加入瓊脂和甘油,加熱溶解,分裝于試管內,115攝氏度(101b)20分鐘高壓滅菌后,制成斜面備用
       
      明膠培養基.
       
      成分:牛肉青3克,蛋白胨5克,明膠120克,蒸儒水1000毫升
      制法,取各成分加在戴儒水中粳泡20分鐘,隨時攪拌加溫使溶解,調叫H至7.4.分裝于試管內,經115攝氏度(101b)20分鐘滅菌后,直立制成高層備用
       
      硝酸鹽蛋白胨水培養基
      成分:蛋白胨10克,酵母浸膏3克,硝酸鉀2克,亞硝酸鈉0.5克,蒸餾水1000毫升
      制法:將蛋白陳和醇母浸青加到蒸餾水中.加溫使溶解,調pH為7.2,煮佛過濾后補足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉.溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,115攝氏度(10Ib)20分鐘滅菌后備用
       
      普通瓊脂斜面培養基
      成分:
      蛋白胨10克,牛肉青3克,氯化鈉5克,瓊脂15克,蒸餾水1000
      制法:除瓊脂外.將其余成分溶解于蒸餾水中,調pH為7.2~7.4.加入瓊脂.加熱溶解.分裝試管,121攝氏度(15Ib)15分鐘高壓滅菌后.制成斜面備用
       
      儀器
      培養箱:37攝氏度.42攝氏度,錐形燒瓶,試管,滅菌平皿,滅菌刻度吸管,顯微鏡,載玻片,接種針、接種環,電爐,商壓消毒鋼
       
      操作步驟
      增菌培養:取1:10樣品稀釋液10毫升加到90毫升SCDLP被體培養基中,置37攝氏度培養18至24小時.如有綠膿桿菌生長,培養液表面多有一層薄菌膜.培養液常呈黃綠色或藍綠色.
      注,如無SCDLP罐體墻養基時.可用普通肉湯培蕎基.檢驗含防腐劑的化妝品時,在每1000毫升普通肉湯中加1克卵磷脂.7克吐溫80.
       
      分離培養:從培養液的薄菌膜處挑取培養物,劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上.置37攝氏度培養18至24小時.凡綠膿桿菌在此培養基上,其菌落扁平無定型,向周邊擴散或略有蔓延,表面濕潤.菌落呈灰白色,菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素,此培養基選擇性強,大腸艾希氏菌不能生長,革蘭氏陽性菌生長較差.
      在缺乏十六燒三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離,將菌液劃線接種于平血中,放37攝氏度培養24小時.綠膿桿菌在此培養基上生長良好,菌落自平.邊緣不整,菌落周圍培養基略帶粉紅色,其他菌不生長.
      染色鏡檢:挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色,鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試臉.
      氧化酶試驗:取-小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內,用無菌玻璃槔挑取綠膚桿菌可疑菌落涂在濾紙片.上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液,在15至30s之內,出現粉紅色或紫紅色時,為氧化酶試驗陽性,若培養物不變色.氧化酶試驗陰性.
      綠膿菌素試驗:取可疑菌落2至3個,分別接種在綠膿菌素測定用培養基上,置37攝氏度培養24小時,加入氧仿3至5毫升,充分振蕩使培養物中的綠脹麴崠溶解于氧仿液內,待氧仿提取液呈藍色時,用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1毫升左右,振葛后,靜置片刻.如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性,表示被檢物中有綠膿菌素存在.
      硝酸鹽還原產氣試驗:挑取被檢的純培養物,按種在硝酸鹽胨水培養基中,置37攝氏度培養24小時.觀察結果.凡在硝酸鹽陳術培養基內的小倒管中有氣體者,即為陽性.表明該菌能還原硝酸鹽,井將亞硝酸鹽分解產生氨氣.
      明膠液化試驗.取綠驗桿菌可疑菌落的純培養物,穿刺接種在明膠培養基內,置37攝氏度培養24小時,取出放冰箱10至30分鐘,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性.如凝固不將者為陰性.
      42攝氏度生長試驗:挑取純培養物.接種在普通瓊脂斜面培養基上,放在41至42攝氏度培養箱中.培養24至48小時,綠膿桿菌能生長,為用性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長.
      檢驗結果報告
      被檢樣晶經增菌分離培養后,經證實為革蘭氏陰性桿菌.氧化酶及綠膿蘭素試驗皆為用性者.即可報告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌.如綠膿的素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42攝氏度生長試驗三養皆為陽性時.仍可報告被檢樣品中有綠膿桿菌.
       
      附加說明:
      本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口.
      本標準由“化妝晶微生物標準檢驗方法"起草小組起草.
      本標準主要起草人周淑玉.
      本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋.