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    1. 微生物分離純化及鑒定技術

      發布時間:

      2022-12-18

      作者:

      微生物培養基公司


      微生物分離純化及鑒定

       

      微生物鑒定是指借助現有的分類系統,通過對未知微生物的特征測定,對其進行細菌、酵母菌和霉菌大類的區分,或屬、種及菌株水平確定的過程,它是藥品微生物檢驗中的重要環節.

       

      非無菌產品的微生物檢查:對選擇培養基或指示培養基上發現的疑似菌落需進行鑒定;

      控制菌檢查(通則1106)

      無菌檢查法(通則1101)

      對陽性實驗結果中分離的微生物進行鑒定,以判定試驗是否重試;

       

      藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則(通則9203),對潔凈室和其他受控環境分離到的微生物進行鑒定,以掌握環境微生物污染情況,有助于污染調查;

       

      其他

      對藥物原料、輔料、制藥用水、生產環境、中間產物和終產品中檢出的微生物進行適當水平的鑒定.

       

      微生物鑒定需達到的水平視情況而定,包括屬、種鑒定和菌株分型

      常規特征分析(屬水平鑒定)

      大多數非無菌藥品生產過程和部分無菌生產環境的風險評估中,對所檢出微生物的常規特征包括菌落形態學、細胞形態學、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生化反應進行分析.

      種水平鑒定

      非無菌藥品產品的控制菌檢查應達到種的水平

      菌株分型

      無菌試驗結果陽性和無菌生產模擬工藝失敗時,對檢出的微生物鑒定一般需達到菌株水平.

      分離純化技術

      獲得純培養物對微生物學研究至關重要,平板劃線法是分離純化常用技術.

      純培養物是指來源于同一單細胞的細胞群體

      在劃線過程中,細胞逐漸分散,培養后可形成單個菌落.

      成功獲得純培養物依賴于樣品中混合在一起的細胞是否有效的被相互分開.

       

      1、20201

      初篩實驗

      可能導致染色結果不理想的原因:

      老齡培養物可能導致革蘭氏染色不確定,選用新鮮培養的細菌;

      過度加熱固著可能使革蘭氏陽性菌變為革蘭氏陰性菌;

      脫色劑使用過多會出現假陰性,使用太少有可能出現假陽性.

      2、芽胞染色21210

      細菌能否形成芽胞以及芽胞的形狀、芽胞在芽胞囊內的位置、芽胞囊是否膨大等特征是鑒定細菌的依據之一.

      20210芽孢染色液

      規格:10ml×4支/盒;包裝內容:孔雀綠染色液3支、番紅染色液1支

       

      由于芽孢在結構和化學成分上均有別于營養細胞,所以芽孢也就具有了許多不同于營養細胞的特性.芽孢是整個生物界中抗逆性最強的生命體,對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學物質都有很強的抗性.

      例如,肉毒梭菌的芽胞在沸水中要經過5至9.5h才被殺死;巨大芽胞桿菌芽胞的抗輻射能力比E.coli細胞要強36倍.芽胞的休眠能力更為突出,在常規條件下,一般可以保持幾年至幾十年而不死.據文獻記載,有的芽胞甚至可以休眠數百至數千年,最極端的例子是在美國的一塊有2500萬~4000萬年歷史的琥珀,至今從其中蜜蜂腸道內還可以分離到有生命的芽胞.

      是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標.【50203枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片:用于環氧乙烷滅菌效果檢測;50204嗜熱脂肪桿菌芽孢菌片:用于壓力蒸汽滅菌效果檢測】芽孢是細菌的休眠體,在適宜的條件下可以重新轉變成為營養態細胞;產芽孢細菌的保藏多用其芽孢.(如何獲得芽孢?)產芽孢的細菌多為桿菌,也有一些球菌.芽孢的有無、形態、大小和著生位置是細菌分類和鑒定中的重要指標.芽孢與營養細胞相比化學組成存在較大差異,容易在光學顯微鏡下觀察.

      50203枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片使用方法:

      使用時將裝有菌片的小紙袋放在被滅菌的物品中心部位(每鍋放置菌片數按衛生部規定或其它相關標準規定).

      滅菌后,無菌操作取出小紙袋中的菌片,投放到營養肉湯(產品編號10204,按使用說明配制,分裝試管,5ml/支,滅菌后4℃保存備用)中.同時將兩片未經滅菌的菌片分別投入兩管營養肉湯中作對照.

      37℃培養7天,觀察結果,對照管呈混濁:若滅菌后營養肉湯澄清透明,則為陰性,表示滅菌徹底;若滅菌后營養肉湯渾濁,則為陽性,表示滅菌不徹底.

      當出現陽性結果時,為確定是否為滅菌后接種操作過程中操作不當污染所致,可使用無菌操作取0.2ml營養肉湯涂布接種至營養瓊脂(產品編號10103)平板上,置37℃培養48小時,涂片鏡檢或作進一步試驗.

      枯草芽孢桿菌為G+桿菌,極易形成芽孢,芽孢位置位于菌體中央,不膨大.芽孢染色為孔雀綠著色.在營養瓊脂上菌落呈棕色并隨時間延長菌落逐漸著上黑色.

      50204嗜熱脂肪桿菌芽孢菌片:

      使用時將裝有菌片的小紙袋放在被滅菌的物品中心部位(每鍋放置菌片數按衛生部規定或其它相關標準規定),視需要也可將小紙袋盛于試管等特定容器中再進行滅菌

      滅菌后,無菌操作取出小紙袋中的菌片,投放到溴甲酚紫蛋白胨培養液(產品編號10114,按使用說明配制,分裝試管,5ml/支,滅菌后4℃保存備用.)中.同時將未經滅菌的菌片投入另一管培養液中作對照.

      56℃±1℃培養48小時,觀察結果,對照管呈黃色:若滅菌后菌片培養液呈紫色,則陰性,表示滅菌徹底;若滅菌后菌片培養液呈黃色,則為陽性,表示滅菌不徹底.

      嗜熱脂肪芽孢桿菌為G+桿菌,芽孢染色為孔雀綠著色.

      3、其他染色技術

      抗酸染色;鞭毛染色;內含物-異染粒染色

       

      4、需氧類型

      接種:用1小環(外徑1.5毫米的接種環)的肉湯菌液,穿刺接種到培養基中,穿刺到管底.30℃培養,分別在3至7天觀察結果.

      結果觀察:如細菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌,如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌.

       

      5、生化篩選實驗

      1)氧化酶試驗:(20202)

      用于區分不發酵的革蘭氏陰性桿菌(氧化酶陽性)和腸道菌(氧化酶陰性)

      原理:氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素C氧化,然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應.

      操作:暗室中,使用無菌鑷子取出一張紙片,滴加1滴無菌生理鹽水浸濕,挑取新鮮的待

      檢菌苔涂抹于紙片上,1分鐘內紙片變紫則為陽性.試驗副溶血性弧菌為陽性,大腸埃希氏菌為陰性

      應用:腸桿菌科氧化酶陰性,非發酵菌氧化酶陽性(個別除外),弧菌科,奈瑟菌屬、莫拉菌屬陽性.

      注:本品見光易變質,請于暗室保存,使用時避免遇強光;待檢菌苔必須是新鮮的,且無雜菌,否則極易造成誤判

      2)過氧化氫酶試驗(20706)

      原理:具有過氧化氫酶的細菌,能催化過氧化氫生成水和原子態氧,繼而形成分子氧,出現氣泡.

      操作:接種環挑取培養24h菌種一環,涂抹于滴有3%H2O2的玻片上.

       

      應用:革蘭氏陽性球菌中,葡萄球菌和微球菌均產生過氧化氫酶,而鏈球菌屬為陰性,故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群.

      3)凝固酶試驗

      凝固酶:致病性葡萄球菌大多能產生凝固酶,非致病葡萄球菌不產生此酶.凝固酶分為結合型和游離型兩種.

      結合型凝固酶:結合在細胞壁,與纖維蛋白原結合,使纖維蛋白原變為纖維蛋白,引起細菌凝集,采用玻片法檢測;

      游離型凝固酶:分泌至細菌體外,被血漿中凝固酶反應因子激活,形成葡萄球菌凝血酶,使纖維蛋白原變為纖維蛋白,導致血漿凝固,采用試管法檢測.

      操作:

      玻片法——取潔凈玻片一張,滴加兔血漿(20802)一滴;用接種環取實驗菌苔一環,在兔血漿中研磨混勻;結果觀察:如出現顆粒狀凝集現象即為血漿凝固酶實驗陽性.如不立即發生凝集,可輕搖玻片加速反應,若仍無凝集則為陰性.

      試管法——取肉湯培養物0.5ml同0.5ml兔血漿于試管內充分混合,置36±1℃培養;定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6h,以內容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時不流動者為陽性.

      陽性對照:金黃色葡萄球菌兔血漿&凍干兔血漿

      4)碳水化合物氧化和發酵

      不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣.可用指示劑及發酵管檢驗.

      實驗方法:

      以無菌操作,用接種針或環移取純培養物少許,接種于發酵液體培養基管,若為半固體培養基,則用接種針作穿刺接種.

      接種后,置36±1℃培養,每天觀察結果,檢視培養基顏色有無改變(產酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產氣陽性,若為半固體培養基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力、培養物可呈彌散生長.